211service.com
Chirurgia genomowa
Precyzyjne i łatwe sposoby przepisywania ludzkich genów mogą w końcu dostarczyć narzędzi, których naukowcy potrzebują, aby zrozumieć i wyleczyć niektóre z naszych najbardziej śmiertelnych chorób genetycznych. 11 luty 2014
W ciągu ostatniej dekady, gdy technologia sekwencjonowania DNA rozwijała się coraz szybciej i taniej, nasza wiedza na temat ludzkiego genomu odpowiednio wzrosła. Jednak naukowcy do niedawna pozostawali w dużej mierze krępowani, gdy próbowali bezpośrednio modyfikować geny w żywej komórce. Weźmy na przykład anemię sierpowatą. Wyniszczająca i często śmiertelna choroba, spowodowana jest mutacją tylko w jednej z trzech miliardów par zasad DNA pacjenta. Chociaż ten błąd genetyczny jest prosty i dobrze zbadany, naukowcy są bezradni, aby go naprawić i powstrzymać jego niszczycielskie skutki.
Teraz jest nadzieja w postaci nowych narzędzi inżynierii genomu, w szczególności narzędzia o nazwie CRISPR. Technologia ta może umożliwić naukowcom wykonywanie mikrochirurgii na genach, precyzyjnie i łatwo zmieniając sekwencję DNA w dokładnych lokalizacjach na chromosomie. Wraz z techniką zwaną TALEN, wynalezioną kilka lat temu i nieco starszym poprzednikiem opartym na molekułach zwanych nukleazami palca cynkowego, CRISPR może sprawić, że terapie genowe będą miały szersze zastosowanie, zapewniając lekarstwa na proste zaburzenia genetyczne, takie jak anemia sierpowata, a ostatecznie nawet prowadząc do leki na bardziej złożone choroby obejmujące wiele genów. Większość konwencjonalnych terapii genowych z grubsza umieszcza nowy materiał genetyczny w losowym miejscu w komórce i może dodać tylko gen. W przeciwieństwie do tego, CRISPR i inne nowe narzędzia dają również naukowcom precyzyjny sposób usuwania i edytowania określonych fragmentów DNA — nawet poprzez zmianę pojedynczej pary zasad. Oznacza to, że mogą dowolnie przepisywać ludzki genom.
Ta historia była częścią naszego wydania z marca 2014 r.
- Zobacz resztę numeru
- Subskrybuj
Prawdopodobnie minie co najmniej kilka lat, zanim takie wysiłki zostaną rozwinięte w terapię dla ludzi, ale coraz większa liczba naukowców akademickich odniosła pewien wstępny sukces w eksperymentach dotyczących anemii sierpowatej, HIV i mukowiscydozy (patrz tabela poniżej). Jednym z nich jest Gang Bao, badacz bioinżynierii z Georgia Institute of Technology, który już wykorzystał CRISPR do skorygowania mutacji sierpowatych komórek ludzkich hodowanych w naczyniu. Bao i jego zespół rozpoczęli pracę w 2008 roku przy użyciu nukleaz palca cynkowego. Kiedy pojawiły się TALEN, jego grupa szybko się zmieniła, mówi Bao, a następnie zaczęła używać CRISPR, gdy to narzędzie stało się dostępne. Chociaż ma ambicje, aby ostatecznie pracować nad różnymi chorobami, Bao mówi, że ma sens zacząć od anemii sierpowatej. Jeśli wybierzemy chorobę do leczenia za pomocą edycji genomu, powinniśmy zacząć od czegoś stosunkowo prostego, mówi. Choroba spowodowana pojedynczą mutacją w jednym genie, która dotyczy tylko jednego typu komórki.
Bao ma pomysł, jak taka kuracja będzie działać. Obecnie lekarze są w stanie wyleczyć niewielki procent pacjentów z anemią sierpowatą, znajdując ludzkiego dawcę, którego szpik kostny jest zgodny z układem odpornościowym; Chirurdzy mogą następnie zastąpić niektóre komórki macierzyste szpiku kostnego pacjenta komórkami od dawcy. Ale tacy dawcy muszą być dokładnie dopasowani do pacjenta, a nawet wtedy odrzucenie układu immunologicznego – potencjalnie śmiertelny problem – stanowi poważne ryzyko. Lekarstwo Bao pozwoliłoby uniknąć tego wszystkiego. Po zebraniu prekursorów krwinek zwanych hematopoetycznymi komórkami macierzystymi ze szpiku kostnego pacjenta z anemią sierpowatą, naukowcy wykorzystali CRISPR do skorygowania wadliwego genu. Następnie skorygowane genowo komórki macierzyste byłyby zwracane pacjentowi, wytwarzając zdrowe czerwone krwinki zastępujące komórki sierpowate. Nawet jeśli uda nam się wymienić 50 proc., pacjent poczuje się znacznie lepiej – mówi Bao. Jeśli wymienimy 70 proc., pacjent zostanie wyleczony.
Chociaż edycja genomu za pomocą CRISPR ma niewiele ponad rok, już teraz odkrywa na nowo badania genetyczne. W szczególności daje naukowcom możliwość szybkiego i jednoczesnego wprowadzania wielu zmian genetycznych w komórce. Na wiele ludzkich chorób, w tym choroby serca, cukrzycę i różne schorzenia neurologiczne, wpływa wiele wariantów zarówno genów chorobowych, jak i genów prawidłowych. Wydobywanie tej złożoności za pomocą modeli zwierzęcych było procesem powolnym i żmudnym. W przypadku wielu pytań w biologii chcemy wiedzieć, jak różne geny oddziałują na siebie, i w tym celu musimy wprowadzić mutacje do wielu genów, mówi Rudolf Jaenisch, biolog z Whitehead Institute w Cambridge Massachusetts. Ale, mówi Jaenisch, użycie konwencjonalnych narzędzi do stworzenia myszy z pojedynczą mutacją może zająć nawet rok. Jeśli naukowiec potrzebuje zwierzęcia z wieloma mutacjami, zmiany genetyczne muszą być wprowadzane sekwencyjnie, a harmonogram jednego eksperymentu może rozciągać się na lata. Natomiast Jaenisch i jego koledzy, w tym badacz z MIT Feng Zhang (członek naszej listy 35 innowatorów poniżej 35 roku życia z 2013 r.), donieśli zeszłej wiosny, że CRISPR umożliwił im stworzenie szczepu myszy z wieloma mutacjami w ciągu trzech tygodni.
Ponieważ system CRISPR można łatwo zaprojektować tak, aby celował w dowolny konkretny gen, technologia umożliwia naukowcom przeprowadzanie eksperymentów, które badają dużą ich liczbę. W grudniu zespoły kierowane przez Zhanga i badacza z MIT Erica Landera stworzyły biblioteki CRISPR, z których każda jest ukierunkowana na inny ludzki gen. Te ogromne kolekcje, zawierające prawie wszystkie geny człowieka, zostały udostępnione innym badaczom. Biblioteki obiecują przyspieszyć badania całego genomu dotyczące genetyki raka i wielu innych chorób człowieka.
Genom GPS
Przemysł biotechnologiczny narodził się w 1973 roku, kiedy Herbert Boyer i Stanley Cohen wprowadzili do bakterii obce DNA, które zmanipulowali w laboratorium. W ciągu kilku lat Boyer był współzałożycielem Genentech, a firma zaczęła używać E coli zmodyfikowany ludzkim genem do produkcji insuliny dla diabetyków. W 1974 roku Jaenisch , a następnie w Salk Institute for Biological Studies w San Diego, stworzył pierwszą transgeniczną mysz, wykorzystując wirusy do wzbogacenia genomu zwierzęcia odrobiną DNA innego gatunku. Jednak w tych i innych wczesnych przykładach inżynierii genetycznej badacze ograniczyli się do technik, które losowo wprowadzały obce DNA do komórki. Jedyne, co mogli zrobić, to mieć nadzieję na najlepsze.
Minęło ponad dwie dekady, zanim biolodzy molekularni stali się biegli w skutecznej zmianie określonych genów w genomach zwierzęcych. Dana Carroll z University of Utah uznała, że nukleazy palca cynkowego, białka opracowane przez kolegów z Johns Hopkins University w 1996 roku, mogą być używane jako programowalne narzędzie do namierzania genów. Jeden koniec białka można zaprojektować tak, aby rozpoznawał konkretną sekwencję DNA; drugi koniec tnie DNA. Kiedy komórka w naturalny sposób naprawia te nacięcia, może łatać swój genom, kopiując z dostarczonego obcego DNA. Chociaż technologia w końcu umożliwiła naukowcom pewne wprowadzanie zmian w chromosomie tam, gdzie chcą, jest trudna w użyciu. Każda modyfikacja wymaga od badacza zaprojektowania nowego białka dopasowanego do docelowej sekwencji — trudne, czasochłonne zadanie, które, ponieważ białka są wybredne, nie zawsze działa.
TALEN, kolejny znaczący postęp w edycji genów, pojawił się w 2010 roku. TALEN są również białkami, które znajdują i przecinają pożądaną sekwencję DNA – ale dostosowanie ich do nowych docelowych genów jest znacznie łatwiejsze. Chociaż reprezentowały one znaczną poprawę w porównaniu z palcami cynkowymi, TALEN są dużymi białkami, które są kłopotliwe w pracy i dostarczaniu do komórek.
CRISPR zmienił wszystko. Zastępuje białka celujące w DNA krótkim fragmentem RNA, który gromadzi się w pożądanych genach. W przeciwieństwie do złożonych białek, RNA – który ma prawie taką samą prostą strukturę jak DNA – może być rutynowo wytwarzany w laboratorium; technik może szybko zsyntetyzować mniej więcej 20-literowe sekwencje, których wymaga metoda. System ułatwia naukowcom medycznym modyfikowanie genomu poprzez zastępowanie, usuwanie lub dodawanie DNA.
W niewiele ponad rok, CRISPR rozpoczął odkrywanie na nowo badań genetycznych.
CRISPR oznacza zgrupowane, regularnie rozmieszczone, krótkie powtórzenia palindromiczne — skupiska krótkich sekwencji DNA, które czytają podobnie do przodu i do tyłu, które można znaleźć w wielu typach bakterii. Naukowcy po raz pierwszy zaobserwowali zagadkowe segmenty DNA w latach 80. XX wieku, ale przez prawie dwie dekady nie rozumieli, że są one częścią bakteryjnego systemu obronnego. Kiedy wirus atakuje, bakterie mogą włączać sekwencje wirusowego DNA do własnego materiału genetycznego, umieszczając je między powtarzającymi się segmentami. Następnym razem, gdy bakterie napotkają tego wirusa, wykorzystują DNA z tych klastrów, aby wytworzyć RNA, które rozpoznają pasujące sekwencje wirusowe. Białko przyłączone do jednego z tych RNA następnie tnie wirusowy DNA.
W 2012 roku Emmanuelle Charpentier, mikrobiolog medyczny, który bada patogeny w Helmholtz Center for Infection Research, oraz Jennifer Doudna , współpracownik z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley, wykazał, że mogą użyć pojedynczego RNA w połączeniu z białkiem tnącym, enzymem zwanym Cas9, do wycinania dowolnej pożądanej sekwencji DNA w probówkach. Wciąż nie było pewności, czy metoda zadziała w komórkach zwierzęcych, ale w styczniu 2013 roku nastąpił dramatyczny przełom. Zhang i George Church, genetyk z Harvard Medical School, osobno poinformowali, że system CRISPR/Cas9 można wykorzystać do edycji genów w komórkach zwierząt, w tym ludzi.
Teraz badacz, który chce znaleźć nowy gen, musi jedynie zsyntetyzować białko Cas9 i trochę RNA, które pasują do sekwencji docelowego regionu. Następnie RNA kieruje enzym do DNA, które badacz chce wyciąć. A ponieważ to samo białko tnące jest używane niezależnie od celu, naukowcy mogą projektować eksperymenty, w których jednocześnie zmieniają wiele genów w organizmie przy użyciu Cas9 i wielu przewodników RNA. Daje możliwość przeprowadzania eksperymentów, które w przeszłości były bardzo trudne lub w zasadzie niemożliwe, mówi Doudna.
Złożone tajemnice
Zhang z MIT, członek Broad Institute i McGovern Institute for Brain Research, interesuje się genetyką stojącą za chorobami psychicznymi. Aby spróbować zrozumieć te złożone warunki, Zhang pomógł opracować wiele narzędzi do modyfikacji genów i neuronów, w tym TALEN i optogenetykę, technikę, która polega na kontrolowaniu aktywności neuronów za pomocą światła laserowego. Kiedy po raz pierwszy usłyszał o CRISPR, w 2011 roku, zaczął opracowywać go do użytku w ludzkich komórkach. Teraz używa CRISPR do ujawnienia genetycznych sekretów kryjących się za tak wyniszczającymi i słabo poznanymi schorzeniami, jak schizofrenia i autyzm.
Narzędzie pozwala Zhangowi rozpocząć systematyczne testowanie niektórych wariantów DNA, które są powiązane z chorobami. Chociaż w ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w identyfikowaniu genów, które są powszechne u osób z tymi schorzeniami, zrozumienie, w jaki sposób te geny odnoszą się do objawów, jest zniechęcającym wyzwaniem. To, czego uczysz się z sekwencjonowania, to tylko obserwacja, mówi Zhang: aby zrozumieć, czy podejrzany gen rzeczywiście powoduje chorobę, musisz wprowadzić konkretną mutację do zdrowych komórek lub organizmów i zobaczyć, co pójdzie nie tak. Jeśli zmutowana komórka lub organizm ma cechy naśladujące ludzką chorobę, jest to dowód na istnienie genu.
Zhang może odtworzyć, zarówno u myszy laboratoryjnych, jak i hodowanych ludzkich komórek, warianty genetyczne znalezione u osób z autyzmem i schizofrenią. Możesz umieścić ludzką mutację w odpowiednim genie u zwierzęcia laboratoryjnego, a następnie zobaczyć: czy to zwierzę staje się mniej społeczne lub ma deficyt uczenia się? on mówi. Następnie, dodaje, można badać różnice w zachowaniu i fizjologii neuronów wyhodowanych w laboratorium wyhodowanych z komórek macierzystych, które zostały zmodyfikowane tą samą mutacją. Mówi, że dzięki mutacjom pojedynczego genu zaczniemy dostrzegać aspekty funkcji biologicznej, które są zaangażowane w autyzm.
Zhang używa również CRISPR do jednoczesnego wprowadzania wielu zmian genetycznych. Staje się to szczególnie ważne w przypadku złożonych chorób, takich jak autyzm i schizofrenia, które w większości nie są spowodowane typem pojedynczej zmiany DNA stojącej za anemią sierpowatą. Różni pacjenci są dotknięci różnymi kolekcjami mutacji. Rozwiązanie zagadki o tak ogromnej złożoności będzie wymagało dużych, systematycznych badań nad skutkami różnych genów i sposobami ich interakcji. CRISPR umożliwia takie badania, mówi Zhang, i będzie ważne w poszukiwaniu sposobów leczenia różnych złożonych chorób. Dowiemy się więcej o szlakach i mechanizmach chorób, mówi. Ta wiedza będzie informować o wszelkiego rodzaju opracowywaniu leków.
Projektant dzieci
Pod koniec ubiegłego roku Doudna, Zhang, Church i dwaj inni pionierzy edycji genomu założyli startup, który opracuje nowe metody leczenia ludzkich chorób genetycznych. W listopadzie firma, Wydane leki , ogłosił, że zebrał 43 miliony dolarów kapitału podwyższonego ryzyka i powiedział, że planuje wykorzystać technologie edycji genomu przeciwko szerokiej gamie chorób.
Wprowadzenie na rynek Editas powinno skorzystać na odrodzeniu zainteresowania terapią genową dzięki wieloletnim ulepszeniom technologicznym, w tym bezpieczniejszym mechanizmom prowadzenia leczenia. Krajobraz zmienił się dla terapii genowej, mówi Church. (Nadal nie ma zatwierdzonych terapii genowych w Stanach Zjednoczonych, chociaż wiele jest w trakcie prób na ludziach). Ale mówi, że terapie, które opracuje Editas, będą zasadniczo różnić się od starszych podejść, które wykorzystują wirusa do wprowadzania genu do komórek.
Być może naukowcy mogliby przepisać normalne geny, aby ludzie mogli lepiej zwalczać infekcje.
Church mówi, że dokonywanie zmiany lub usunięcia jest poza zasięgiem większości tych prostych metod wirusowych. A usunięcie fragmentu DNA zamiast dodawania genu może rzeczywiście być kluczem do leczenia wielu chorób. Weź chorobę Huntingtona. Śmiertelny stan mózgu wynika z nagromadzenia się toksycznego białka w neuronach. Dodanie zdrowej kopii genu do komórki nie wpłynie na toksyczną aktywność tego białka: oryginalna, dysfunkcyjna wersja musi zostać przepisana. Dzięki nowym narzędziom do edycji genomu, mówi Church, przepisanie wadliwego DNA może być możliwe: nie jesteś ograniczony do dodawania czegoś, czego brakuje. I dodaje, kiedy zaczynasz zdawać sobie sprawę, że najczęstsze wersje genów niekoniecznie są wersjami idealnymi, wtedy zdajesz sobie sprawę, że to znacznie szersza dziedzina. Być może naukowcy mogliby przepisać normalne geny, aby ludzie mogli lepiej zwalczać choroby zakaźne. Mogą nawet wstrząsnąć szlakami molekularnymi związanymi ze starzeniem się.
Church przewiduje również, że jeśli edycja genomu zostanie wykorzystana do leczenia chorób wieku dziecięcego, niektórzy naukowcy będą mieli pokusę wykorzystania jej do inżynierii embrionów podczas zapłodnienia in vitro. Naukowcy wykazali już, że edycja genomu może przepisać sekwencje DNA w embrionach szczurów i myszy, a pod koniec stycznia naukowcy z Chin poinformowali, że stworzyli genetycznie zmodyfikowane małpy za pomocą CRISPR. Dzięki takim technikom genom danej osoby może być edytowany przed urodzeniem lub, jeśli dokonano zmian w jajeczkach lub komórkach wytwarzających spermę przyszłego rodzica, jeszcze przed poczęciem.
Te możliwości rodzą pytania etyczne. Ale jeśli naukowcy udowodnią, że mogą bezpiecznie korygować choroby poprzez edycję genomu, nieuniknione jest, że niektórzy rodzice będą chcieli również zmienić genomy zdrowych embrionów. „Jeśli możesz zapobiec opóźnieniu umysłowemu za pomocą terapii genowej, zakładając, że jest to dopuszczalne, to istnieje całe spektrum wyzwań intelektualnych, które zostaną omówione”, mówi Church.
Takie dyskusje mogą się zaognić, gdy CRISPR stanie się powszechniej stosowany. Na razie jednak technologia wciąż ewoluuje: podczas gdy badacze tacy jak Bao, Church i Zhang ostatecznie mają nadzieję wyleczyć niektóre z naszych najbardziej nieuleczalnych chorób, większość czasu nadal spędzają na dopracowywaniu narzędzia i odkrywaniu jego możliwości. Ale nawet w tych wczesnych dniach CRISPR już zmienił sposób myślenia tych badaczy o manipulowaniu genomem. Już nie mają pięści.