Nieintuicyjna technika rozogniskowania pozwala uzyskać trójwymiarowe obrazy mikroskopowe

Jednym z wielkich wynalazków w historii był rozwój mikroskopu. Możliwość zobaczenia ogromnej różnorodności życia i wzorców w tak małej skali zmieniła nasze rozumienie świata i nasz stosunek do niego.

Od tego czasu mikroskopiści radykalnie ulepszyli swoje instrumenty, dzięki czemu mogą rejestrować nie tylko w świetle widzialnym, ale także w innych długościach fal, a nawet z innymi nośnikami zapisu, takimi jak elektrony, neutrony i tak dalej.

Jednym z najtrudniejszych wyzwań jest jednak określenie trójwymiarowej struktury małych obiektów. Na przykład zdrowe czerwone krwinki mają słynną strukturę w kształcie pączka, a zmiany tej struktury są ważnym wskaźnikiem różnych chorób i stanów.

Te kształty są łatwe do zobaczenia, ale określenie ich całej trójwymiarowej struktury z rozdzielczością kilkuset nanometrów jest trudne; nie tylko dlatego, że czerwone krwinki są w dużej mierze przezroczyste i trudne do zauważenia za pomocą zwykłej mikroskopii w jasnym polu.

Dzisiaj Paula Roma i koledzy z Federalnego Uniwersytetu Minas Gerais w Brazylii ujawniają nową i stosunkowo prostą technikę określania całej trójwymiarowej struktury czerwonych krwinek, opartą na sprzecznej z intuicją technice rozogniskowania.

Biolodzy od dawna dostrzegają ograniczenia mikroskopii jasnego pola z próbkami biologicznymi, ponieważ wiele z nich jest w dużej mierze przezroczystych. (Mikroskopia jasnego pola to zwykła technika mikroskopowa, z którą większość ludzi spotyka się w szkole średniej.)

Światło pada na próbkę lub przez nią, ukazując wszystko, co silnie pochłania lub rozprasza światło.

Problem polega na tym, że wszystko, co jest przezroczyste, jest mniej lub bardziej niewidoczne, ponieważ światło przez nie przechodzi. I niestety, wiele próbek biologicznych należy do tej kategorii – w tym czerwone krwinki, które są w dużej mierze przezroczyste.

Jednym ze sposobów jest nieznaczne rozogniskowanie obrazu. Ponieważ czerwone krwinki mają współczynnik załamania światła, zaginają przechodzące przez nie światło. To zginanie wprowadza zmianę fazy w świetle.

Ta zmiana fazy ułatwia oddzielenie tego światła od światła, które nie przeszło przez komórkę. W ten sposób czerwone krwinki stają się ciemniejsze i łatwiejsze do zobaczenia.

Pozwala to na bardziej szczegółową analizę komórek. Mierząc zmiany intensywności jakie wprowadza ten proces, możliwe jest opracowanie kształtu powierzchni generującej zmiany fazowe. Daje to trójwymiarowy obraz górnej powierzchni komórki.

Teraz Roma i spółka twierdzą, że można iść dalej. Pokazują, że wykonując dwa zdjęcia komórki, oba rozogniskowane w różnym stopniu, można również opracować kształt dolnej powierzchni komórki. Innymi słowy, ten dziwny rodzaj rozmytego obrazu stereo daje trójwymiarowy kształt całej komórki.

Wyniki są imponujące. Technika działa ze zwykłym białym światłem, chociaż musi ono zostać przefiltrowane, aby usunąć czerwone długości fal, które mogą wchłonąć czerwone krwinki.

Aby uzyskać dwa obrazy tej samej komórki, Roma i spółka używają rozdzielacza wiązki, aby wysłać światło do dwóch kamer, które są rozogniskowane w różnym stopniu. Wyniki mogą być następnie przetwarzane przy użyciu prostego algorytmu w celu uzyskania trójwymiarowych obrazów komórek

Aby przetestować ten pomysł, Roma i spółka umieścili czerwone krwinki w różnych stężeniach roztworów soli, aby pęczniały. Zarejestrowali obrazy 25 komórek i przetworzyli wyniki, które pokazano powyżej.

Mówią, że obrazy mają rozdzielczość w granicach 300 nanometrów, znacznie lepszą niż jest to możliwe przy użyciu podobnych technik. W szczególności pokazują, jak komórki przylegają do powierzchni, do której są przyczepione.

Konfiguracja jest również stosunkowo prosta. Mówią, że technika może być łatwo zaadoptowana przez niespecjalistów.

To interesujący wynik, który pokazuje, jak fascynujące, tanie postępy można nadal poczynić w mikroskopii.

Nr ref.: http://arxiv.org/abs/1404.2968 : Całkowite obrazowanie 3D obiektów fazowych przy użyciu mikroskopii rozogniskującej: zastosowanie czerwonych krwinek

ukryć