RNA na receptę

To szampan dla każdego. Phil Zamore wyciąga korek z butelki Montaudona, zanurzając w nowiutkim dywanie. Wszyscy w jego laboratorium napełniają szklankę, żeby wznieść toast na szefa. Niespodziewanie dobre wieści, wyjaśnia. Zamore, biochemik z University of Massachusetts Medical School w Worcester, właśnie otrzymał krajową nagrodę o wartości 1 miliona dolarów w ciągu pięciu lat. Budżet laboratorium właśnie się potroił.

Zamore, co zrozumiałe, jest oszołomiony i nie chodzi tylko o pieniądze. Pole Zamore, interferencja RNA lub RNAi, ma zaledwie kilka lat, ale szturmem podbiło świat biologii. RNAi to najbardziej ekscytujący wgląd w biologię w ciągu ostatniej dekady lub dwóch, mówi laureat Nagrody Nobla Phillip Sharp, biolog z MIT. A laboratorium Zamore jest jednym z garstki, które porusza pole naprzód w zawrotnym tempie. Myślę, że każdy, kto pracuje w terenie, czuje się trochę zadyszany postępem, mówi Zamore.

Ta historia była częścią naszego wydania z grudnia 2002 r.

• Zobacz resztę numeru
• Subskrybuj

Poczucie podekscytowania, którym podzielają Zamore, Sharp i inni badacze, jest uzasadnione. Przez dziesięciolecia naukowcy myśleli, że RNA jest jedynie posłańcem DNA, niewolniczo dostarczającym plany białkowe DNA. Ale teraz wydaje się, że maleńkie podwójne nici RNA, wprowadzone do komórek lub zwierząt wyhodowanych w laboratorium, mogą szybko i skutecznie wyłączyć dowolny gen.

Konsekwencje są zapierające dech w piersiach, ponieważ żywe organizmy są w dużej mierze definiowane przez znakomicie zaaranżowane włączanie i wyłączanie genów. Biolodzy do tej pory byli w stanie jedynie naśladować ten proces przełączania w sposób powolny, ociężały i pośredni. Ale łatwość, z jaką RNAi może wyłączyć geny, twierdzą naukowcy, wydaje się niemal mistyczna. Techniki laboratoryjne wykorzystujące RNAi są już preferowanymi przez biologów metodami odkrywania funkcji poszczególnych genów. I obiecuje nowy sposób bezpośredniego leczenia chorób poprzez wyłączenie kluczowych genów zaangażowanych w różne dolegliwości. Już teraz co najmniej osiem firm – w tym jedna założona przez Zamore’a, Sharpa i współpracowników – pracuje nad terapiami RNAi na wszystko, od chorób wirusowych po raka.

„Świętym Graalem” jest przekształcenie tego wszystkiego w narkotyki, mówi Zamore. By móc dać ci małe, zakłócające RNA, które wyłączyłoby ekspresję twojego genu wysokiego cholesterolu. To obniżyłoby poziom zapalenia wątroby typu C infekującego wątrobę. A może, jak sądzę, w największej aplikacji typu „pie-in-the-sky”, która skupiłaby się na genie specyficznym dla komórek nowotworowych i zabiłaby nowotwór.

Nie wiadomo, jak szybko to się stanie. Interferencja RNA wdarła się do świadomości świata naukowego na dorocznym spotkaniu Towarzystwa RNA w Banff, Alberta, w maju 2001 r. Tam, Sayda Elbashir, stażysta w laboratorium biochemika Thomasa Tuschla w Instytucie Chemii Biofizycznej im. Gttingen w Niemczech zaskoczył słuchaczy wiadomością, że maleńkie dwuniciowe fragmenty RNA szybko, łatwo i specjalnie wyłączają geny w ludzkich komórkach, rolę, jaką naukowcy nigdy wcześniej nie widzieli w odgrywaniu RNA.

Większość słuchaczy po prostu siedziała i mówiła sobie: Nauka właśnie się zmieniła” – wspomina biochemik z University of Michigan, David Engelke. Jedyną rzeczą, która zapobiegła pandemonium, było to, że wcześniej obiecano nam tego typu rzeczy. Sceptycznie nastawiony Engelke czekał kilka miesięcy. Potem zaczęły napływać te raporty: Rany, to naprawdę działa!”.

Niespodzianka RNA

Do niedawna raczej mało efektowna rola, jaką biolodzy przypisywali RNA, polegała na pasywnym przekazywaniu informacji genetycznej z DNA do maszynerii wytwarzającej białka w komórce. W tym procesie kod DNA genu jest transkrybowany na kopię RNA, którą maszyneria komórkowa przekłada na białko. W interferencji RNA krótkie bity RNA blokują proces, niszcząc wiadomość po drodze. Dwuniciowe fragmenty RNA prowadzą enzymy tnące do RNA, które niesie przekaz genetyczny. Informacyjny RNA jest następnie cięty i oznaczany do zniszczenia: wiadomość genu jest skutecznie wyciszana.

Biolodzy od lat wiedzą, że jednoniciowe cząsteczki RNA zaprojektowane do parowania z informacyjnym RNA mogą zatrzymać produkcję białka, ale ten sztuczny proces jest zawodny nawet w laboratorium. Natura jednak reguluje geny za pomocą RNA, w szczególności dwuniciowych cząsteczek.

Pierwsze oznaki tego zjawiska pojawiły się w 1990 roku, ale w tamtym czasie naukowcy nie powiązali tego, co zaobserwowali, z RNA. W tym samym roku biolog roślin Rich Jorgensen, wówczas z DNA Plant Technology w Oakland w Kalifornii, próbował nadać fioletowym petuniom głębszy odcień fioletu. Wstawił nową, doładowaną kopię genu, który kontroluje produkcję fioletowego pigmentu. Ku jego zaskoczeniu dostał białe petunie. Jorgensen zdawał sobie sprawę ze znaczenia tego paradoksalnego efektu, ale nie potrafił wyjaśnić, dlaczego dodanie większej ilości genu wyłączyło ten gen.

Kolejna wskazówka pojawiła się w 1995 roku, kiedy genetycy z Cornell University sklonowali gen mikroskopijnego robaka glebowego C. elegans . Aby zweryfikować swoje odkrycie, użyli standardowej metody laboratoryjnej, aby wyłączyć gen: dodali pojedynczą nić RNA, która pasowała do informacyjnego RNA. Ta komplementarna nić wiąże się z posłańcem, uniemożliwiając jego przekształcenie w białko. Nieoczekiwanie, niekomplementarna pojedyncza nić RNA, której używali jako eksperymentalnej kontroli i która nie powinna nic zrobić, również zamknęła gen.

W 1998 biochemik Andrew Fire z Carnegie Institution of Washington i genetyk Craig Mello z University of Massachusetts Medical School rozwiązali zagadkę. Wstrzykując komplementarne pojedyncze nici RNA do robaków, uzyskano zdumiewająco silny efekt wyciszania, gdy obie nici się połączyły. Po wykazaniu, że dwuniciowy RNA jest prawdziwym czynnikiem wyciszającym, Fire i Mello ukuli termin interferencja RNA i narodziła się nowa dziedzina. Z perspektywy czasu, naładowane fioletowe geny Jorgensena dały dwuniciowe RNA, które miały taki sam wpływ na natywne geny fioletu, zasadniczo je odcinając.

Wydaje się, że dwuniciowe RNA zapewnia bardziej stabilny i niezawodny sposób na odcięcie określonych genów niż pojedyncze nici, a laboratoria badające organizmy, w tym rośliny, robaki i muchy, chętnie przyjęły nową metodę. Jednak interferencja RNA nie działała u ssaków: układ odpornościowy niszczy komórki, które zawierają dwuniciowe RNA, aby bronić się przed wirusami RNA, takimi jak te, które powodują zapalenie wątroby typu A i C. Potem przyszło objawienie Tuschla i Elbashira w Banff, że bardzo krótkie segmenty RNA, które nazwali małym interferującym RNA, zadziałało w ludzkich komórkach. W tym momencie, mówi Sharp, całe pole wystartowało.

Ciche leczenie

Teraz śledczy szukają sposobów na przekształcenie tej potężnej nowej roli RNA w zyski korporacyjne. Praktycznie wszystkie firmy farmaceutyczne już wykorzystują interferencję RNA jako narzędzie do odkrywania leków. Jedna z najpopularniejszych strategii znajdowania nowych celów narkotykowych polega na wybijaniu lub wyłączaniu genów jeden po drugim, aby zobaczyć, co się stanie. Jeśli, na przykład, chore zwierzę można wyleczyć poprzez wyłączenie określonego genu, białko tego genu może być dobrym celem dla leku. Okazuje się, że użycie małych interferujących RNA może radykalnie przyspieszyć ten proces. Zamiast spędzać miesiące lub lata na inżynierii nokautu, naukowcy wykorzystują RNA do specyficznego i szybkiego wyłączenia genu. Mogą również zaobserwować, czy wyłączenie białka – jako leku – spowoduje skutki uboczne. Proces odbywa się w ciągu kilku dni, a nie roku, mówi Christophe Echeverri, dyrektor generalny Cenix BioScience, firmy biotechnologicznej z Drezna w Niemczech.

W ostatecznym zastosowaniu małe interferujące RNA mogą same w sobie być lekami: zamiast blokować określone białko, jak to robią standardowe leki, RNAi zapobiegłoby powstaniu białka. W czerwcu ubiegłego roku firma Sharp z MIT wykazała, że ​​takie RNA, ukierunkowane na kluczowe geny wirusowe i ludzkie, mogą powstrzymać zakażenie wirusem HIV w komórkach hodowanych w laboratorium. W jednym eksperymencie naukowcy zmieszali komórki zakażone wirusem HIV z małymi interferującymi RNA ukierunkowanymi na geny wirusowe. RNA zatrzymały reprodukcję wirusa. Grupa Sharpa mieszała również niezainfekowane komórki z małymi interferującymi RNA skierowanymi na CD4, białko na powierzchni komórek, przez które wnika wirus HIV. Naukowcy wykazali, że RNA zmniejszyło produkcję CD4. Dwa i pół dnia później wystawili komórki traktowane RNA i komórki nieleczone na HIV. Wirus zainfekował cztery razy więcej nieleczonych komórek.

Pomimo zachęcających wyników, na razie leki RNAi wciąż są w fazie snu, mówi Sharp. Jednak Sharp uznał wczesną obietnicę za wystarczająco kuszącą, by wspólnie z Zamorem, Tuschlem i dwoma innymi naukowcami – firmą Alnylam Pharmaceuticals z Cambridge w stanie Massachusetts – opracować takie leki. Firma ledwo ruszyła z miejsca, gdy w lipcu zeszłego roku zapewniła 17 milionów dolarów finansowania venture capital.

Jednak wytwarzanie leków RNAi nie będzie łatwe. Po pierwsze, nikt nie znalazł odpowiednich metod podawania RNA ludziom. Wystąpił problem z dostawą. To takie proste, mówi chemik z Uniwersytetu Harvarda, Stuart Schreiber. Doprowadzanie kwasów nukleinowych do tkanek docelowych [jest] nierozwiązanym problemem w medycynie. Terapia RNAi jest zasadniczo terapią genową, mówi Schreiber, i stanie przed tymi samymi problemami – nieskutecznością, nieskutecznością i immunologicznymi skutkami ubocznymi – które zablokowały tę dziedzinę od 1999 roku, kiedy Jesse Gelsinger zmarł podczas próby terapii genowej na Uniwersytecie Pensylwanii. Tamtejsi lekarze używali zmodyfikowanych wirusów jako nośników lub wektorów do przenoszenia DNA do komórek nastolatka. Układ odpornościowy Gelsingera zareagował masowo i śmiertelnie.

Sharp mówi, że istnieje nadzieja, że ​​małe, zakłócające RNA może nie potrzebować wektorów, aby osiągnąć swój cel, unikając w ten sposób większości pułapek związanych z terapią genową opartą na DNA. Ale ten scenariusz jest daleki od pewności. Czy możesz zmodyfikować RNA, aby były bardziej stabilne [i] aby były bardziej efektywnie pobierane przez komórki? Ostry pyta. Nie wiemy.

Mieć sens

Najnowsza historia biomedyczna nie pomaga rozstrzygnąć niepewności. W rzeczywistości nie jest to pierwszy raz, kiedy naukowcy próbowali stworzyć lek oparty na wyciszającym RNA. Jednoniciowy antysensowny RNA lub DNA może również blokować geny – i nie potrzebuje wektora. Wewnątrz komórki antysensowna cząsteczka znajduje swój komplementarny informacyjny RNA i, jak dwie strony zamka błyskawicznego, ściśle się wiąże, zapobiegając przedostawaniu się informacyjnego RNA przez maszynerię wytwarzającą białka w komórce. Rezultatem, przynajmniej teoretycznie, jest wyłączenie genu.

Jednak antysens był jak dotąd rozczarowaniem jako podstawa nowych leków. Po ponad dekadzie intensywnych prac rozwojowych, tylko jeden lek antysensowny – Vitravene firmy Isis Pharmaceuticals, przeznaczony do leczenia niektórych rzadkich infekcji oczu u pacjentów z AIDS – uzyskał aprobatę Agencji ds. Żywności i Leków. Pierwsza generacja leków antysensownych, które testowano na początku lat 90., szybko rozkładały się w organizmie, trudno było dostać się do komórek, często nie znajdowały swojego celu i powodowały poważne skutki uboczne. Obecnie testuje się na ludziach bardziej stabilne leki antysensowne.

Czy RNAi może działać lepiej niż antysens? Nie w najbliższym czasie, przewiduje Frank Bennett, wiceprezes ds. badań antysensownych w Isis. Jeśli porównasz RNAi z obecną wersją antysensu, tak naprawdę nie ma żadnej przewagi, mówi. [Mała zakłócająca] technologia RNA jest naprawdę w powijakach. Jest to trochę równoważne sytuacji, w której antysens był 10 lat temu, kiedy dopiero zaczynaliśmy eksperymentować na zwierzętach.

Ale ludzie RNAi postrzegają swoją technologię jako zasadniczo różną od antysensu. Wielką zaletą RNAi nad antysensem jest to, że i oto, to naprawdę działa, mówi dyrektor generalny Cenix, Echeverri. Mówi, że RNAi jest znacznie silniejszy i bardziej niezawodny niż antysens. Projekty antysensowne były zazwyczaj postrzegane jako projekty samobójcze, mówi. Mógłbyś spędzić dużo czasu, aby to zadziałało, a to nigdy by nie zadziałało. Nie miałbyś nic do pokazania. Większa siła działania RNAi, zdaniem Echeverri, powinna przynieść lepsze terapie. A ponieważ do wyciszenia genu potrzeba mniej leku, powinno być mniej skutków ubocznych.

Ludzie zmagają się z antysensem, a oto technologia, która naprawdę działa, zgadza się Jon Wolff, dyrektor naukowy Mirus, firmy zajmującej się terapią RNA w Madison, WI. Antysens jest trudny do odtworzenia, ale RNAi to coś, co działa zaraz po wyjęciu z beczki.

Ale czy RNAi może być tylko kolejną przereklamowaną technologią? Dowód jest w budyniu, mówi Echeverri. W ciągu ostatnich dwóch, trzech lat RNAi po prostu całkowicie przejęło kontrolę. Wszyscy się do niego zwracają; próbują tego w każdym organizmie. I nie byłby tak popularny, gdyby nie odniósł sukcesu.

Wyciszanie wątpliwości

Nikt jeszcze nie wypróbował RNAi u ludzi, ale jedna firma jest blisko: Ribopharma, biotechnologiczny start-up w Kulmbach w Niemczech. Ponad rok przed tym, jak grupa Tuschla oszołomiła społeczność naukową swoimi wiadomościami, założyciele Ribopharma, byli wykładowcy Uniwersytetu Bayreuth, Roland Kreutzer i Stefan Limmer, odkryli, że małe RNA działają w komórkach ssaków. Tak przynajmniej twierdzą Kreutzer i Limmer. Nigdy nie opublikowali swoich danych.

Kreutzer i Limmer stwierdzili, że fizycznie niemożliwe jest, aby bardzo długie RNA, takie jak te używane przez Fire i Mello, związały się jednocześnie z docelowymi RNA. Zostaną tylko krótkie odcinki. Próbowali więc wyciszyć geny ssaków za pomocą wystarczająco krótkich RNA, aby uniknąć śmiertelnej odpowiedzi immunologicznej. To był hazard, mówi Limmer. I okazało się, że to naprawdę działa. Naukowcy złożyli wniosek patentowy, zrezygnowali z pracy dydaktycznej, aw czerwcu 2000 roku założyli Ribopharma.

Dyrektorzy Ribopharma planują rozpocząć badania na ludziach w przyszłym roku, prawdopodobnie zaczynając od testów małych interferujących RNA w leczeniu czerniaka złośliwego i raka trzustki. Kreutzer i Limmer twierdzą, że ich konstrukty RNA są wystarczająco stabilne, aby działać bez wektorów i można je wstrzykiwać bezpośrednio w miejsce guza lub do krwiobiegu. Firma zebrała ponad 18 milionów dolarów. Ale ponieważ Ribopharma jeszcze nie opublikowała swoich wyników, trudno jest ocenić jej twierdzenia, mówią inni badacze RNA. Robili pewne rzeczy, mówi Sharp z MIT, całkiem ładnie… [Ale] to długa droga.

Jak długo? Postawy wahają się od optymistycznych zapewnień Ribopharma po silny pesymizm. David Beach, prezes startupu RNAi Genetica w Cambridge, MA, wskazuje na ponad dekadę antysensownej odysei. Nie chcę siedzieć i argumentować, że wdrożenie RNAi w trybie terapeutycznym byłoby prostsze, mówi.

O wiele jaśniejsze jest to, że RNAi zmusza biologów do ponownego przemyślenia roli RNA. W ciągu ostatnich kilku lat naukowcy odkryli setki genów kodujących małe cząsteczki RNA, zwane mikroRNA, w organizmach, od roślin i robaków po ludzi. Podobnie jak ich mali kuzyni z RNA, mikroRNA wydają się wyciszać geny, ale ich rola w biologii jest w większości nieznana. Wiele z nich zostało bardzo dobrze zachowanych w toku ewolucji; [więc] muszą robić coś ważnego, mówi biolog z MIT David Bartel. Tymczasem uświadomienie sobie, że RNAi jest naturalnym i prawdopodobnie podstawowym procesem zachodzącym w roślinach i zwierzętach, pomogło uczynić z niego jedną z najbardziej ekscytujących tajemnic dzisiejszej biologii.

Małe geny RNA mogą być biologicznym odpowiednikiem ciemnej materii wokół nas, ale prawie umykają wykryciu, napisał Gary Ruvkun, biolog molekularny z Harvard Medical School, w 2001 roku w czasopiśmie. Nauka . Co robią te tajemnicze geny? Podejrzewam, że to, na co patrzymy, to bardzo stara metoda kontrolowania ekspresji genów, mówi Zamore.

Jeśli mikroRNA są przełącznikami decydującymi o tym, czy komórki macierzyste stają się neuronami lub mięśniami, czy też komórki rakowe rosną, czy umierają, to interferencja RNA jest o wiele ważniejsza, niż ktokolwiek wyobrażał sobie jeszcze kilka lat temu. Po prostu natknęliśmy się na zupełnie nową gałąź biologii molekularnej, o której wcześniej nie wiedzieliśmy – mówi Engelke z Michigan.

Dla optymistów te przełomy zwiastują szybki rozwój skutecznych leków. I nawet badacze biomedyczni, cynicznie nastawieni przez ekstrawaganckie twierdzenia o magicznych lekarstwach, uważają, że RNAi może być po prostu prawdziwym. W zeszłym roku, kiedy RNAi po raz pierwszy zadziałało w ludzkich komórkach, wszyscy obudzili się i powiedzieli: „Ciekawe, czy to srebrna kula?” – mówi Engelke. I może być. Może być.

Firmy opracowujące zakłócenia RNA SPÓŁKA PODSTAWOWE ZNAKI RNAi Alnylam farmaceutyki
(Cambridge, MA)
Lecznictwo Benitec
(Brisbane, Australia)
Własność intelektualna dla genomiki i terapeutyki Cenix BioScience
(Drezno, Niemcy)
Identyfikacja celów leków i terapia nowotworowa Devgen
(Gandawa, Belgia) Identyfikacja celu leków i leczenie cukrzycy, depresji i choroby Parkinsona Genetyka
(Cambridge, MA)
Identyfikacja celu leków na raka Miru
(Madison, WI)
Terapie z użyciem długiego dwuniciowego RNA rybofarma
(Kulmbach, Niemcy) Leki na raka i zapalenie wątroby typu C

ukryć