Sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki DNA

W rogu biura Helicos BioSciences w Cambridge, MA, ekran na twarzy czegoś, co wygląda jak gigantyczna lodówka, wyświetla odliczanie: 10 dni, pięć godzin i 51 minut, aż zakończy odczytywanie sekwencji całego DNA, zostały do ​​niego wprowadzone. Maszyna o wysokiej przepustowości, złożona konfiguracja rur, laserów i chemikaliów, zawiera dwie płytki, każda z wytrawionymi w niej 25 mikroprzepływowymi kanałami. Każdy kanał może pomieścić i sekwencjonować oddzielną próbkę DNA. Sekwencjonując próbki równolegle, maszyna potrzebuje zaledwie godziny, aby odczytać 1,3 miliarda zasad chemicznych – znanych jako A, C, T i G – które tworzą nić DNA.

HeliScope jest pierwszą komercyjną maszyną, która sekwencjonuje pojedynczy fragment DNA, a nie jeden wielokrotnie kopiowany. Każda komórka przepływowa (powyżej) ma 25 kanałów, z których każdy może pomieścić 16 milionów nici DNA do sekwencjonowania. Powłoka na powierzchni ogniwa umożliwia jej mycie do czysta pomiędzy reakcjami.

Nazywany HeliScope, jest pierwszym komercyjnym instrumentem, który może bezpośrednio odczytać sekwencję pojedynczej takiej nici, co daje mu potencjał do niespotykanej dotąd szybkości. W rzeczywistości, mówi Stephen Quake, bioinżynier ze Stanford University, który był współzałożycielem firmy w 2003 roku, Helicos w zasadzie zbudował najszybszy na świecie sekwencer DNA. Chociaż nie jest jasne, czy maszyna wytworzy kompletną sekwencję szybciej niż konkurencyjne systemy (dane generowane przez maszynę do sekwencjonowania nadal muszą być analizowane i łączone, co jest zadaniem wymagającym dużej mocy obliczeniowej), Quake twierdzi, że otwiera zupełnie nowe obszary Badania.

Ta historia była częścią naszego wydania z lipca 2008 r.

• Zobacz resztę numeru
• Subskrybuj

HeliScope, wprowadzony na początku tego roku, dołącza do intensywnego wyścigu o szybsze i tańsze technologie sekwencjonowania. Cena sekwencjonowania ludzkiego genomu spadła w ostatnich latach z 300 milionów dolarów, które Human Genome Project wydał na pierwszą wersję roboczą, do mniej niż 100 000 dolarów. Zastosowania taniego sekwencjonowania są niemal nieograniczone, od diagnostyki chorób po badania, które mogą doprowadzić do powstania drobnoustrojów zaprojektowanych do produkcji biopaliw lub leków.

W innych obecnie stosowanych zaawansowanych technologiach sekwencjonowania, w tym tych z Illumina, Applied Biosystems i 454 Life Sciences (która została przejęta przez Roche w zeszłym roku), DNA, które ma być sekwencjonowane, musi być wielokrotnie powielane lub kopiowane; kopie są następnie odczytywane jednocześnie, aby ułatwić wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych, które wskazują położenie każdej litery DNA. Sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek pomija etap kopiowania, co oznacza, że ​​w jednym eksperymencie sekwencjonowania można upakować o wiele więcej unikalnych próbek.

Multimedia

• Obejrzyj proces Helicos Biosciences dotyczący sekwencjonowania pojedynczej cząsteczki DNA.

• Stephen Quake, współzałożyciel Helicos Biosciences, opowiada o sekwencjonowaniu.

Ponadto sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek może być w stanie wygenerować pełniejszy obraz genomu. Dzieje się tak dlatego, że gdy DNA jest amplifikowane, niektóre struny z większym prawdopodobieństwem zostaną pomyślnie skopiowane niż inne, więc istnieje większe prawdopodobieństwo, że będą one reprezentowane w końcowej sekwencji. Podobnie rzadkie mutacje genetyczne mogą pozostać niereprezentowane, ponieważ nie są kopiowane. Jeśli pod koniec dnia możesz po prostu umieścić pojedynczą nić DNA na platformie i bezpośrednio ją zsekwencjonować, jest to ogromna zaleta, mówi Elaine R. Mardis, współdyrektor Centrum Genomu na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St. Louis.

Obudź się w nocy
Dzięki technologii Helicos DNA, które ma zostać zsekwencjonowane, jest najpierw cięte na krótkie kawałki o długości około 200 zasad i wstrzykiwane do komórki przepływowej, specjalistycznego szkiełka. Komórka przepływowa jest pokryta maleńkimi fragmentami DNA, które mają na celu zaczepienie fragmentów, gdy przepływają obok, zakotwiczając je w miejscu. Unieruchomione fragmenty DNA są znakowane fluorescencyjnie, dzięki czemu ich pozycja pod mikroskopem fluorescencyjnym może być rejestrowana przez kamerę. W jednym eksperymencie sekwencjonowania można przeanalizować prawie miliard fragmentów DNA, w porównaniu z około 400 000 do 50 milionów w przypadku innych technologii.

Komora przepływowa jest następnie umieszczana w HeliScope, gdzie mikroskop jest osadzony w 400 funtach granitu Vermont. Dodana waga zapobiega zakłócaniu przez wibracje sygnałów, które urządzenie musi wykryć. Złożony układ optyczny i plątanina rurek otaczają mikroskop, łącząc go z czymś, co wygląda jak miniaturowa lodówka wypełniona butelkami specjalnie przygotowanych chemikaliów.

Kiedy naukowiec uruchamia maszynę, rozpoczyna się precyzyjnie zaplanowany taniec płynów. Enzym zwany polimerazą DNA i jeden rodzaj fluorescencyjnie znakowanej zasady – powiedzmy A – wpływają do komórki. Enzym powoduje, że te As zajmują swoje miejsca w rosnących niciach DNA, które uzupełniają nici w próbkach. (Każda z czterech zasad może sparować się tylko z jedną inną zasadą, więc dodane A musi znajdować się naprzeciwko istniejącego T, a C naprzeciw G.) Po włączeniu fluorescencyjnie oznaczonej zasady do nowej nici kamera HeliScope może dostrzec światło, które emituje. Imager wykrywa pióropusz – 200-nanometrowy stożek światła – z integracji pojedynczej [zasady] z pojedynczą nitką DNA, mówi Steve Lombardi, prezes Helicos.

Inne zaawansowane metody sekwencjonowania wykorzystują podobne podejście, znane jako sekwencjonowanie przez syntezę. Ale w przeciwieństwie do tych technologii, HeliScope potrafi rozróżnić niewzmocniony sygnał fluorescencyjny pojedynczej zasady zajmującej miejsce na rosnącej nici DNA. Jednym z kluczy do tej zdolności jest opracowany przez firmę materiał zapobiegający przywieraniu, który powleka powierzchnię kuwety przepływowej i umożliwia jej mycie do czysta między reakcjami: resztkowe zasady fluorescencyjne utrudniałyby dokładne wykrywanie poszczególnych reakcji sekwencjonowania. Musisz upewnić się, że do powierzchni nie przyklejają się żadne dodatkowe molekuły zasady, mówi Patrice Milos, dyrektor ds. naukowych w Helicos. To było jedno z największych wczesnych wyzwań. Po każdym cyklu znaczniki fluorescencyjne są odcinane z nowo wprowadzonych zasad, a pozostałe chemikalia są wypłukiwane. Proces powtarza się sekwencyjnie z każdą z czterech zasad.

HeliScope co sekundę generuje ogromną ilość surowych danych. Odczytanie całego DNA, które można załadować do dwóch komórek przepływowych, zajmuje od pięciu do dziesięciu dni; w przypadku sekwencjonowania jest to 400 milionów nici DNA na komórkę, które mogą wygenerować użyteczną sekwencję o wartości 20 miliardów zasad. Naukowcy ładują maszynę, naciskają przycisk na jej twarzy i wychodzą. Ale mający obsesję na punkcie sekwencjonowania może używać Internetu do sprawdzania postępów maszyny w środku nocy, co jest częstym zjawiskiem w Helicos.

Gdy HeliScope utworzy serię zdjęć fluorescencyjnych, towarzyszące mu centrum przetwarzania danych przekształca je w ciągi liter. Oprogramowanie wkleja te elementy razem, tworząc dłuższą sekwencję.

Brakujące mutacje
W artykule opublikowanym w Nauka na początku tego roku naukowcy donieśli o wykorzystaniu HeliScope do sekwencjonowania genomu wirusa M13, co jest ważnym dowodem na to, że sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek może być wykorzystane do odczytania i złożenia sekwencji całego genomu. (Długość około 7000 par zasad, genom wirusa M13 jest niewielki – około milionowej wielkości człowieka). Technologia jest tak nowa, że ​​nie jest jeszcze jasne, do jakich zastosowań będzie najlepiej przystosowany. Jednak niektórzy naukowcy uważają, że sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek może być szczególnie ważne dla zrozumienia, w jaki sposób zmiany genetyczne przyczyniają się do choroby. W końcu niektóre rzadkie mutacje związane z chorobą mogły zostać pominięte w poprzednich badaniach genomicznych, ponieważ nie zostały skopiowane podczas procesu amplifikacji.

Helicos wciąż majstruje przy technologii, rozwijając chemię, która może przyspieszyć reakcje sekwencjonowania i umożliwić zakotwiczenie większej liczby fragmentów DNA w komórce przepływowej. Wraz z innymi głównymi graczami w tej dziedzinie, firma ma nadzieję dostarczyć kompletną sekwencję genomu za 1000 USD, co oznaczałoby początek czegoś zupełnie nowego w medycynie: zdolności jednostek do uzyskania dostępu do własnych informacji genomowych.

Emily Singer jest DZIECI redaktor ds. biotechnologii i nauk przyrodniczych.

ukryć