Sekwencjonowanie w mgnieniu oka

6 lutego 2007 r. dyrektorzy 454 Life Sciences pokazali 78-letniemu Jamesowi Watsonowi pierwszy szkic jego własnego genomu. Było w tym coś wręcz poetyckiego. Watson oczywiście otrzymał Nagrodę Nobla 45 lat wcześniej za swoją rolę w odkryciu podwójnej helisy DNA; był także głównym inicjatorem Projektu Ludzkiego Genomu, który do jego zakończenia w 2003 roku wydał prawie 3 miliardy dolarów w ciągu 13 lat, wydobywając plan kodowany przez te helisy. Teraz 454 przesunął się o krok poza ten megaprojekt, który zgromadził DNA wielu ludzi, aby określić sekwencję genetyczną tego, co stanowi model człowieka. Firma i jej tak zwana maszyna do sekwencjonowania nowej generacji samodzielnie odczytały kod genetyczny osoby – takiej, której praca przyczyniła się do tego, że osiągnięcie to było możliwe.

Jonathan Rothberg z 454 wierzy, że jego maszyny sprawią, że sekwencjonowanie będzie tak tanie i szybkie, że odczytywanie genomów osobników stanie się praktyczne.

Ale Jonathan Rothberg, który założył 454 w Branford w stanie Connecticut, z marzeniem o wyprodukowaniu maszyny do sekwencjonowania wydajniejszej niż te dostępne w ramach Projektu Ludzkiego Genomu, nie wspomina o poezji, kiedy opowiada o swoim spotkaniu z Watsonem. Mówi raczej o pieniądzach, szybkości i przyszłości, w której zwykli ludzie noszą swoje osobiste genomy na dyskach – co jest coraz bardziej prawdopodobnym scenariuszem. Zrobienie Jima Watsona kosztowało nas 200 000 dolarów, wskazuje Rothberg. A robiliśmy to głównie w grudniu i styczniu.

Ta historia była częścią naszego wydania z maja 2007 r.

• Zobacz resztę numeru
• Subskrybuj

Rothberg, który obecnie przewodniczy radzie dyrektorów 454, podkreśla, że ​​Projekt Jim wciąż trwa i będzie wymagał więcej czasu i pieniędzy. Do lutego firma zsekwencjonowała DNA Watsona tylko trzy razy (każdy przebieg zwiększał dokładność i wypełniał luki); Aby wyprodukować ostateczną sekwencję projektu ludzkiego genomu, wymagane było dziewięć przebiegów. Ale jednak.

Firma Rothberga jest tylko jedną z kilku, w tym Illumina z San Diego i Applied Biosystems z Foster City w Kalifornii, rozwijając maszyny, które mogą dekodować DNA szybciej niż kiedykolwiek wcześniej. I tak jak koszt mocy komputera gwałtownie spadł wraz ze stale rosnącą gęstością tranzystorów na chipach, cena sekwencjonowania DNA gwałtownie spadła wraz z pojawieniem się tych maszyn. Dzisiaj cena genomu ludzkiego zdekodowanego za pomocą sekwenserów typu używanego w Human Genome Project wynosiłaby od 25 do 50 milionów dolarów. Spada do około 1 miliona dolarów dzięki dostępnym dzisiaj maszynom nowej generacji i może wynieść nawet 100 000 dolarów do 2008 roku.

Multimedialne

• Zobacz grafikę tajników sekwencjonowania.

Jak pokazała historia komputerów, większa moc obliczeniowa za mniejsze pieniądze może prowadzić do nieoczekiwanych zastosowań. W następstwie projektu Human Genome Project naukowcy stanęli przed trudnymi decyzjami finansowymi, które genomy zsekwencjonować dalej: szympans czy makak, krowa czy delfin, ryż czy maniok. Nowe maszyny umożliwiają sekwencjonowanie niemal wszystkiego, co jest interesujące. A ponieważ coraz więcej danych sekwencyjnych wpływa do baz danych, otwierają się zupełnie nowe obszary badań. Naukowcy mają teraz bezprecedensową zdolność dokonywania porównań między gatunkami, rzucając światło na wszystko, od pytań ewolucyjnych po genetyczne przyczyny indywidualnych różnic w odporności i podatności na choroby. Badania przeprowadzone na maszynach 454 i opublikowane w czołowych czasopismach obejmują częściowe sekwencjonowanie genomu neandertalczyka i opracowanie nowych testów na mutacje genetyczne wywołujące raka – technologii, która może pomóc lekarzom w dostosowaniu leczenia do swoich pacjentów.

Ubiegły rok był najbardziej ekscytującym okresem w genomice od czasów Projektu Ludzkiego Genomu, mówi Eric Lander, pierwszy autor pierwszego opublikowanego projektu ludzkiego genomu, a obecnie szef Broad Institute for Genome Medicine w Cambridge, MA. . Sekwencjonowanie staje się na tyle tanie i potężne, że można je zastosować do każdego problemu. Stoi pole na głowie. Francis Collins, który kierował Human Genome Project dla National Institutes of Health, przewiduje, że nowe technologie sekwencjonowania będą miały poważne konsekwencje dla przyszłości badań biomedycznych, a ostatecznie dla praktyki medycznej.

Unikalne rozwiązanie
W gabinecie Jonathana Rothberga urządzono jadalnię, z podłogą wyłożoną czerwono-czarną szachownicą, czerwonymi chromowanymi krzesłami pokrytymi naugahyde i sofą z podłokietnikami, które imitują tylną część Cadillaca z 1959 roku, w komplecie z monstrualnymi płetwami ogonowymi i tylnymi światłami w kształcie kul. . Zamiast biurka ma bar ze stołkami barowymi. Na niektórych półkach stoją butelki wina z winnicy w Connecticut, której jest właścicielem. Za oknami leży Long Island Sound. Miejsce krzyczy jestem unikalny . I tak jest z Rothbergiem. W 1991 roku, kończąc doktorat z biologii na Uniwersytecie Yale, założył CuraGen, jedną z pierwszych firm, która opracowuje leki oparte na genomice. Oprócz CuraGen i 454 Life Sciences założył instytut badań nad chorobami wieku dziecięcego i kolejną firmę biotechnologiczną, RainDance Technologies, która opracowała to, co nazywa płytkami obwodów płynnych, które mają na celu zwiększenie wydajności eksperymentów poprzez manipulowanie małymi ilościami płynu. A wszystko to w wieku 43 lat.

Rzeczywiście, to zainteresowanie wyjątkowością każdej osoby ostatecznie skłoniło go do próby zaprojektowania sekwencera, który, jak ma nadzieję, pewnego dnia sprawi, że kontrole genomu będą tak rutynowe, jak obecnie badania krwi. Rothberg trzyma wnętrzności maszyny 454, szklanego szkiełka z 1,6 milionami miniaturowych dołków, każdy o szerokości około 50 mikrometrów (około połowy szerokości ludzkiego włosa) i głębokości 55 mikrometrów. To właśnie ten chip pozwala maszynie tak szybko sekwencjonować DNA, ponieważ w każdym dołku można przeprowadzić oddzielną reakcję chemiczną.

Sekwencjonowanie genów wykorzystuje fakt, że dwie nici helisy DNA są komplementarne: z czterech zasad chemicznych adenina, guanina, tymina i cytozyna, które są nawleczone razem w różnych rzędach na każdej nici, pary adeninowe są tylko z tyminą, oraz guanina tylko z cytozyną. W najczęściej stosowanej technice sekwencjonowania, która opiera się na schemacie opracowanym 30 lat temu przez Fredericka Sangera z University of Cambridge, fragmenty DNA są rozdzielane na pojedyncze nici i poddawane działaniu wolnych nukleotydów, które wiążą się z oryginalnymi As, Cs, Ts, i G do generowania nowych komplementarnych nici. Te nici różnią się długością, ponieważ niektóre z wolnych nukleotydów zostały zmodyfikowane, aby zapobiec kontynuacji reakcji; kiedy jedna z tych zasad zwiąże się ze swoim celem, łańcuch przestaje rosnąć. I każdy z tych czterech typów terminatorów łańcucha ma dołączony inny fluorofor, który fluoryzuje po uderzeniu wiązką lasera. Prąd elektryczny rozdziela pasma według rozmiaru, a laser odczytuje kolory, aby określić, która była ostatnią zasadą dodaną do każdego łańcucha, określając sekwencję. Zdecydowana większość laboratoriów zajmujących się dziś sekwencjonowaniem korzysta z maszyny wyprodukowanej przez firmę Applied Biosystems, która wypluwa około dwóch milionów zasad dziennie.

Najnowszy sekwencer z 454 potrafi czytać 300 milionów dziennie.

Metoda 454 pozwala uniknąć kilku bardziej czasochłonnych etapów konwencjonalnego sekwencjonowania, takich jak rozdzielanie pasm według rozmiaru. W przeciwieństwie do sekwencjonowania Sangera, nie kończy łańcuchów: rejestruje bazy, gdy są one dodawane do rosnącej nici. Najpierw cząsteczka DNA jest losowo dzielona na różne długości. Następnie każdy fragment jest rozbierany na pojedyncze nitki, a każda nitka jest przyczepiana do oddzielnego, małego koralika. Proces biochemiczny kopiuje pojedyncze nici, dzięki czemu z każdej kulki wystaje 10 milionów klonów. Każdy koralik jest następnie pakowany do jednego z 1,6 miliona dołków. As, Cs, Ts i Gs przemywają dołki sekwencyjnie, aby zsyntetyzować nowe komplementarne nici.

Oto naprawdę sprytna część: stosując metodę opisaną po raz pierwszy przez Pål Nyrén i współpracowników ze szwedzkiego Królewskiego Instytutu Technologii, sekwencer 454 natychmiast rejestruje, kiedy do każdej nici dodaje się zasadę, wykorzystując fakt, że reakcja wiązania uwalnia substancję chemiczną zwaną pirofosforanem. W studzienkach maszyny 454 pirofosforan jest wychwytywany przez kaskadę chemiczną, która kończy się aktywowaniem enzymu lucyferazy (który występuje naturalnie u świetlików) – emitując błysk światła. Standardowe urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym, stosowane w aparatach cyfrowych i teleskopach, wykrywa każdy błysk, odczytując sekwencję As, Cs, Ts i Gs w każdym fragmencie. Proces może odczytać około 200 do 300 zasad z rzędu. Podobnie jak w konwencjonalnym sekwencjonowaniu, komputery następnie szukają pasujących sekwencji na końcu jednego fragmentu i na początku drugiego, łącząc fragmenty z powrotem we właściwej kolejności.

Sekwencer, który 454 wprowadził na rynek w październiku 2005 roku, miał kilka poważnych ograniczeń. Potrafił odczytać tylko 100 zasad z rzędu (im dłuższy odcinek zasad w każdym zsekwencjonowanym fragmencie, tym łatwiej jest złożyć cały genom), a także miał problemy z dokładnym mapowaniem powtarzających się odcinków – powiedzmy, sześć As w tył do siebie. Ale Rothberg mówi, że filozofia 454 brzmiała: Wyrzuć to wcześnie; zaakceptuj to. Firma najpierw skupiła się na wczesnych użytkownikach, takich jak Broad's Lander, mając nadzieję, że wkrótce opublikują wyniki oparte na sekwencerze. Najpierw musisz zdobyć wczesnych facetów, ale reszta facetów, obserwujących, jest tam, gdzie jest rynek, mówi Rothberg. I czytają recenzowane artykuły.

Neandertalczycy
Jednym z artykułów jednego z pierwszych użytkowników, który przyciągnął szerokie zainteresowanie zarówno naukowców, jak i opinii publicznej, było badanie DNA neandertalczyka prowadzone przez Svante Pääbo z Instytutu Antropologii Ewolucyjnej im. Maxa Plancka w Lipsku w Niemczech. Neandertalczycy, gatunek najbliższy współczesnemu człowiekowi, zniknęli około 30 000 lat temu, a ich genetyczny związek z nami jest bardziej spekulowany niż faktem. Chociaż Pääbo przeprowadził kilka wcześniejszych badań z DNA neandertalczyka, wszystko poza podstawową analizą okazało się zbyt trudne i kosztowne. Problem polega na tym, że na przestrzeni tysięcy lat nieliczne znane próbki neandertalskiego DNA ze skamielin zostały zdegradowane do krótkich fragmentów liczących około 50 do 75 par zasad. Ponadto DNA jest często zanieczyszczone materiałem genetycznym mikroorganizmów i współczesnych ludzi, którzy mieli do czynienia ze skamieniałościami. Ale Rothberg uważał, że maszyna 454 może analizować wiele krótkich sekwencji niewielkim kosztem, generując wystarczającą ilość informacji, aby umożliwić naukowcom odsiewanie starożytnych skarbów od śmieci. Rothberg nazywany przez zimną Pääbo, który zgodził się na współpracę.

Po zsekwencjonowaniu genów z 70 próbek kości i zębów neandertalczyków zespół Pääbo i badacze z 454 znaleźli jedną próbkę, szacowaną na 38 000 lat, która miała w większości czyste DNA. Jak poinformowali w gazecie opublikowanej jesienią ubiegłego roku Natura , następnie zsekwencjonowali milion par zasad z mniej niż 200 miligramów materiału, osiągnięcie, które dostarczyło wskazówek na temat tego, czy współcześni ludzie i neandertalczycy krzyżowali się ze sobą i kiedy te dwa gatunki oddzieliły się od siebie. Co ważniejsze, artykuł pokazuje, że wykonalne jest sekwencjonowanie wszystkich trzech miliardów zasad w genomie neandertalczyka. Mogłoby to pomóc w rozwiązaniu takich zagadek, jak to, czy neandertalczycy mieli genetyczną zdolność mówienia.

Ustalenie, czy ludzie i neandertalczycy się krzyżowali, a nawet byli w stanie ze sobą rozmawiać, może przyciągnąć wiele uwagi prasy i opinii publicznej, ale inne zastosowania ultraszybkiego sekwencjonowania DNA mogą mieć znacznie większy wpływ na medycynę i nasze życie. Tradycyjna metoda sekwencjonowania analizuje DNA z wielu różnych komórek. Ale jeśli jedna z tych komórek jest, powiedzmy, komórką nowotworową, jej sekwencja może nieznacznie różnić się od sekwencji zdrowych komórek. W takich przypadkach komputery wybierają najczęściej znajdowaną sekwencję i odrzucają pozostałe. Sekwenatory nowej generacji, takie jak te sprzedawane przez 454, zamiast tego klonują i sekwencjonują pojedyncze cząsteczki DNA, umożliwiając ultragłębokie sondowanie, które może odkryć rzadkie warianty. (Tradycyjne sekwensery mogą również analizować pojedyncze cząsteczki, ale jest to zbyt drogie). Konsekwencje sekwencjonowania pojedynczych cząsteczek są ogromne dla medycyny. Chociaż użycie konwencjonalnego sekwencjonowania do wykrycia różnic w DNA między komórkami zdrowymi i chorymi nie jest praktyczne, nowe maszyny mogą z łatwością przeprowadzać takie eksperymenty.

Matthew Meyerson, patolog kliniczny z Dana-Farber Cancer Institute w Bostonie, opublikował badanie pokazujące, w jaki sposób maszyna 454 może pomóc w odkryciu mutacji związanych z rakiem płuc. Obecnie dostępne leki na raka płuc są skierowane na gen, który sekwencjonuje Meyerson, i ma nadzieję, że lekarze ostatecznie zdobędą lepszą kontrolę nad tym, kto zareaguje na które leki, dowiadując się, czy pacjent ma określoną mutację. Wyobrażam sobie, że za kilka lat wszyscy pacjenci z rakiem będą mieli nowotwory charakteryzowane sekwencjonowaniem pojedynczych cząsteczek, jeśli koszty technologii będą nadal spadać, mówi.

W wariacji na ten temat, Michael Kozal, klinicysta AIDS w Yale, dołączył do 454, aby przeprowadzić ultragłębokie sekwencjonowanie wirusa HIV w celu określenia obecności mniejszych populacji wirusów lekoopornych. Wczesne testy tej techniki u pacjentów wykryły około dwukrotnie większą oporność wirusa HIV niż sekwencjonowanie metodą Sangera. Te informacje również mogą pomóc lekarzom w indywidualizacji schematów leczenia, co zwiększy opłacalność. Jest to praktyczne w naszym systemie, mówi 454 główny naukowiec Michael Egholm, który współpracuje z Kozalem. Wcześniej po prostu nie było na to stać.

MójGenom
George Church, pionier sekwencjonowania w Harvard Medical School, mówi, że kluczem są koszty. Ponieważ ich ceny spadną w ciągu najbliższych kilku lat, te maszyny staną się siłą demokratyzującą, która sprawi, że tradycyjne sekwencery staną się niemal przestarzałe, podobnie jak komputery osobiste wyparły komputery typu mainframe. A to doprowadzi do zastosowań, których nikt jeszcze nie może pojąć. Gdybyśmy nadal pracowali na komputerach mainframe, wiele fajnych rzeczy by się nie działo, mówi.

Church, który był jednym z kilkunastu badaczy, którzy w połowie lat 80. zaproponowali Projekt Genomu Ludzkiego, jest jednym z niewielu biologów, których wyposażenie laboratoryjne obejmuje uchwyt do imadła montowany na stole i wiertarkę. Używa takiego sprzętu do budowy własnych sekwenserów nowej generacji, których w jego laboratorium jest obecnie osiem (patrz TR35 , wrzesień/październik 2006 ) . Przekonany, że firmy przepłacają za swoje maszyny, chętnie dzieli się swoim know-how z zainteresowanymi kolegami. Porównuje swoją filozofię do mentalności wiki i Linuksa, mówiąc: Jeśli zbierze się gromada mrówek, mogą przenieść roślinę kauczukowca.

Wielką wizją Churcha jest skierowanie taniego powodzi As, Cs, Ts i Gs w coś, co nazywa Osobistym Projektem Genomu. W Human Genome Project naukowcy pozyskali DNA od kilku osób, z których każda, ze względu na ochronę prywatności, pozostaje anonimowa. Tak więc końcowa sekwencja reprezentuje złożoną osobę z konglomeratem różnych środowisk genetycznych i historii medycznych. Church chce, aby jego Personal Genome Project odszyfrował DNA osób, które również przekażą swoją dokumentację medyczną. Wszystkie wynikowe dane opublikuje w Internecie. Docelowo, jak sobie wyobraża, miliony ludzi dołączą do projektu, zamieszczając w sieci swoje sekwencje, dokumentację medyczną, a jeśli zechcą, nawet zdjęcia twarzy. Cały świat będzie miał wtedy dostęp do wszystkich danych potrzebnych do swobodnego testowania hipotez.

Chociaż Church otrzymał znaczne fundusze od National Institutes of Health na opracowanie technologii sekwencjonowania, kwestie etyczne, prawne i społeczne poruszone w ramach osobistego projektu Genome uniemożliwiły NIH wsparcie tego projektu, pomimo pozytywnej recenzji wniosku o dotację w sierpniu 2005 roku. Jak tylko otrzymałem aprobatę, NIH był podekscytowany, i to niekoniecznie w dobry sposób, mówi. Próbował zająć się kwestiami prywatności i poufności, zauważając, że niczyjej tożsamości nie trzeba upubliczniać, a NIH już finansuje projekty genetyki człowieka, które mają mniej zabezpieczeń.

Church zdaje sobie sprawę, że intymna wiedza na temat własnego DNA może być dla wielu osób zbyt duża. Mówi, że nie pozwalasz swoim dzieciom przeglądać stron pornograficznych w Internecie, a do pewnego stopnia nie pozwalasz sobie na przeglądanie najstraszniejszych, najbardziej obrzydliwych stron. Spodziewa się, że zamiast uzyskać dostęp do ich surowych genomów, ludzie będą mieli specjalistów, którzy pomogą im zinterpretować informacje.

Pomimo braku funduszy federalnych i sprzeciwów etycznych, Kościół postępuje, przekonany, że postęp w technologii sekwencjonowania popchnie ideę Projektu Personal Genome do przodu – tak jak postęp w technologii informacyjnej skłonił obcych do dzielenia się danymi w sposób, o jakim nikomu się nie śniło kiedy 30 lat temu zadebiutował Apple II z podwójnym napędem dyskietek. Wierzy, że wraz ze wzrostem wydajności sekwenserów, a koszty nadal spadają, genomika osobista zacznie działać na skalę, o której niewiele osób sobie jeszcze wyobrażało.

Wygrywać na loterii
W październiku ubiegłego roku X Prize Foundation ogłosiła nagrodę w wysokości 10 milionów dolarów za wyprodukowanie bardzo dokładnych sekwencji 100 ludzkich genomów w 10 dni lub mniej bez wydawania ponad 10 000 dolarów na genom. Jednym z pierwszych uczestników była firma 454, która planuje opracować jeszcze mniejsze koraliki, które, jak ma nadzieję, umożliwią jej maszynom odczytywanie jeszcze większej ilości DNA na przebieg przy mniej więcej tym samym koszcie. Nie potrzebujemy żadnej nowej fizyki ani matematyki, aby dostać się do genomu za 1000 USD, mówi Rothberg.

Pomijając kwestię tego, kiedy – lub czy – ktokolwiek zdobędzie nagrodę X, sekwencjonowanie DNA z pewnością będzie nadal spadać w cenie i zwiększać dokładność. Do zeszłego roku sekwencjonowanie naprawdę walczyło o wywarcie wpływu na następną erę genomiki, której musiało mieć, mówi David Bentley, główny naukowiec Illumina. Zasadniczo cena tradycyjnego sekwencjonowania nie spadała wystarczająco szybko. Teraz sytuacja jest o wiele bardziej optymistyczna niż była, mówi. Sekwencjonowanie nowej generacji ma do odegrania ogromną rolę.

Słuchanie naukowców odhaczających możliwości jest jak słuchanie zwycięzców loterii. A medycyna spersonalizowana, taka jak rodzaj testowania i leczenia raka, które Meyerson z Dany-Farber ma nadzieję pomóc wprowadzić, to tylko punkt wyjścia. Bentley twierdzi, że nowe sekwencery otworzą okna na rozległe niekodujące regiony genomu, które włączają i wyłączają geny. Egholm z 454 zauważa, że ​​Human Genome Project tak naprawdę nie sekwencjonował każdego kawałka ludzkiego DNA; wciąż mogą istnieć nieodkryte geny, które można znaleźć podczas dodatkowego sekwencjonowania. Lander Broada wyobraża sobie strumień nowych informacji o tym, co prowadzi komórkę do różnicowania się na ten czy inny typ (zagadka centralna w biologii rozwoju) i co kontroluje różne stany komórkowe. Zdaję sobie sprawę, że jest to trudniejsze do wyjaśnienia niż leczenie raka, mówi, ale ostatecznie jest to ważniejsze, ponieważ wpłynie na wszystkie choroby.

Lander przewiduje, że w ciągu najbliższego roku naukowcy będą mogli rozpocząć badania, które wygenerują terabazy informacji — jeden bilion As, Cs, Ts i Gs. Nigdy nawet nie powiedziałem tego słowa terabazy przed zeszłym rokiem, mówi. A jeśli wszystkie te dane są w sieci i swobodnie dostępne, będzie to napędzać zupełnie inny rodzaj biologii.

Jon Cohen, niezależny pisarz z San Diego i korespondent Nauka , pracuje nad książką, która analizuje różnice genetyczne oddzielające szympansy od ludzi.

ukryć